Список сокращений
- поглощение при длине волны, равной 280 нанометрам о- поглощение при длине волны, равной 260 нанометрам 9-АА - 9-аминоакридин Акт. - биологическая активность AM - антимутаген
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ИД - индекс деления
Конц-я белка, мг/мл, В. - концентрация белка, определенная спектрофотометрическим методом Варбурга-Кристиана Конц-я белка, мг/мл, Л. - концентрация белка, определенная методом Лоури МННГ - Ы-метил-Ы-нитро-М-нитрозогуанидин НК - нуклеиновые кислоты 2-НФ - 2-нитрофлуорен 4-НХО - 4-нитрохинолин-1-оксид Пост - постзащита или реактивирующее действие Пред и Пр - предзащита или защитное действие Трис - трис(оксиметил)аминометан ЭГ - этиленгликоль ВАР - бенз(а)пирен СА - сульфат аммония
CHAPS - 3[(3-холамидопропил) диметиламмоний]-1-пропансульфонат СВВ - кумасси бриллиантовый голубой DEAE - диэтиламиноэтил DM SO - диметилсульфоксид DTT - дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота IPG — иммобилизованный рН градиент PMSF - фенилметансульфонилфторид РЫР - 2-амино-1метил-5-фенилимидопиридин PSA - персульфат аммония PVDF - поливинилдифлуорид SDS - додецилсульфат натрия
SDS PAGE_- электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата
натрия
S-9 mix - микросомальная активирующая смесь
TEMED - тетраметилэтилендиамин
UV или УФ - ультрафиолетовое облучение
Введение
Человек является частью природы. Влияние человека на среду обитания всегда зависело от этапа развития цивилизации, исторической и географической ситуации.
На данном этапе прогресс сопровождается глобальными экологическими нарушениями и изменениями. Особое внимание вызывает загрязнение окружающей среды факторами, не свойственными биосфере в норме, что не только превосходит компесаторные возможности природы, но влияет на здоровье людей и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению частоты мутаций у микроорганизмов, растений, животных и человека; При этом особенно опасным представляется то обстоятельство, что большинство мутаций рецессивны, то есть они не проявляются в фенотипическом состоянии. Отсутствие фенотипических проявлений позволяет таким мутациям избегать действия естественного отбора и незаметно распространяться Вт популяциях, постепенно накапливаясь. Каждое поколение получает от предыдущего определенное количество мутаций и на протяжении своей жизни в условиях мутагенного загрязнения окружающей среды приобретает еще некоторое дополнительное число, мутаций, передавая последующему поколению значительно больше мутаций. Предотвратить увеличение мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности и тем самым сохранить наследственность - актуальная и.сложная задача стоящая перед человечеством.
Существует несколько подходов к решению проблемы. Предотвращение; загрязнения среды а также идентификация и изъятие мутагенов окружающей среды, весьма эффективны, но их реализация является весьма проблематичной. Одним из подходов является повышение устойчивости организмов к действию экстремальных факторов. Для этих целей возможно использование антимутагенов, веществ, способных снижать частоту спонтанной и индуцированной мутации (Алекперов, 1989).
Прокариоты, как потенциальные источники антимутагенов почти не изучались, хотя, учитывая общность фундаментальных реакций прокариот и эукариот, а также способность прокариот осуществлять реакции некоторых уникальных синтезов, позволили ученым предположить, что бактерии могут быть источниками ценных антимутагенов. Есть и другие положения, подтверждающие важность поиска и использования бактериальных антимутагенов. Во-первых, трудности по получению и использованию микробной биомассы сведены к минимуму, так как бактерии в
7
большинстве своем эффективно наращивают биомассу на дешевых средах (например, на отходах некоторых производств) и за довольно короткий промежуток времени. А также, существуют возможности воздействия на бактериальный метаболизм, позволяющие стимулировать преимущественную выработку необходимого человеку продукта и его дальнейшую экскрецию из клеток. Во-вторых, бактерии являющиеся облигатными составляющими нормальной микрофлоры, а также используемые в приготовлении разнообразных продуктов < представлены главным образом анаэробами. Значит, они в большей степени, чем аэробные микроорганизмы, нуждаются в защите от кислорода и его активных форм, и, следовательно, должны иметь эффективнейшие системы с антимутагенной активностью.
Кроме антимутагенного действия в отношении мутагенеза, индуцированного химическими соединениями, бактерии привлекли к себе внимание исследователей способностью к реактивирующему действию в ответ на стрессовые ситуации. Стресс-это ситуация при которой параметры окружающей среды резко отличаются от обычных условий существования организма. Венгерский врач Ганс Селье, дал имя и идею, стрессорного ответа как запрограмированной реакции организма на резкое изменение условий окружающей среды. Со времен Г. Селье этот термин стал очень популярен и приобрел более широкий смысл, включая сейчас действие экстремальных факторов на биообъект и противодействие им.
Удивительная общность стрессорных ответов у всех исследованных про- и эукариотных организмов позволила выявить высокую консервативность фундаментальных механизмов клеточной регуляции. Поэтому микроорганизмы могут служить моделями для изучения стрессовых ответов.
Целью настоящей работы стало изучение, с одной стороны, антистрессовых, а также антимутагенных свойств пропионовокислых бактерий, что открывает широкие перспективы их практического использования в качестве профилактических и лекарственных препаратов.
Объект наших исследований выбран нами в связи с тем, что пропионовокислые бактерии рассматриваются как перспективные пробиотики, положительное влияние которых на здоровье человека общепризнанно. Пропиновокислые бактерии:
• подавляют активность гнилостных грибов и патогенных грибов,
• образуют витамины группы Вив большом количестве витамина Вп,
• некоторые штаммы вызывают торможение роста раковых клеток,
• обеспечивают защиту от кишечной инфекции.
Кроме того, пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и вьщерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. P. acidipropionici ингибирует акивность /3-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы - ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей. Пропионовые бактерии стимулируют рост фекальных бифидобактерий и помогают в лечении бактериальных дисбактериозов.
1. Обзор литературы
1.1. Пропионовокислые бактерии
1.1.1 Классификация
Пропионовокислые бактерии (ПКБ) относятся к семейству Propionibacteriaceae, роду Propionibacterium. Другой род этого семейства Eubacterium. После исследований X. Дугласа и С. Гантера в род Propionibacterium стали включать виды анаэробных коринебактерий. Коринебактерии живут на поверхности кожи людей; их выделяют также из угрей, ран, крови, гнойных и мягких тканей. Поскольку поверхность кожи людей - главное место обитания коринебактерий, их также стали называть кожными пропионовокислыми бактериями. А бактерии, выделенные из сыра и молока, -молочными или классическими. Классические и кожные пропионовые бактерии различают не только места их обитания, но также и ряд биохимических особенностей. Так классические пропионовые бактерии, в отличие от кожных, не образуют индол и не способны к гидролизу жедатины. Кроме того, коринебактерии обладают высокой протеолитической активностью и отличаются от молочных пропионовых в отношении температурного оптимума (у кожных пропионовокислых бактерий 37° и классических ЗО°С).
На основании работ К. ван Ниля и других исследователей в седьмом издании определителя Bergey (1957) описывается 11 видов (классических) пропионовокислых бактерий. Однако, после установления высокой степени гомологии ДНК число видов сокращено до 4 (таблица 1).
В 1988 г. в род Propionibacterium под названием P. propionicum включена Arachniapropionica ранее включаемая в род Actinomyces. Эта бактерия образует нитчатые ветвистые клетки, в отличие от палочковидных клеток других пропионовокислых бактерий, что делает род Propionibacterium гетерогенным в морфологическом отношении.
В 1983 г. Л.И. Воробьева и др. предложили включить в род Propionibacterium пропионовокислые кокки, имеющие с палочковидными бактериями много общих свойств и высокую степень гомологии ДНК. Новый вид предложено называть P. coccoides, однако официального статуса вида не получил. В 2000 г. на основании методов молекулярной биологии он был включен в род Luteococcus.
10
Таблица 1.1 Виды рода Propionibacterium (Воробьева, 1995)
Название видов и групп, принятых в Первоначальное название видов
1988 г.
Классические
P. freudenreichii P. freudenreichii, P. shermanii
P. thoenii P. thoenii, P. rubrum
P. jensenii P. jensenii, P. zeae, P. technicum,
P. rafftnosaceum, P. petersonii
P. acidi-propionici P. arabinosum. P. pentosaceum
P. coccoides*
Кожные P. acnes Corynebacterium acnes
С. avidum
P. avidum
P. granulosum С. granulosum
P. propionicum Arachnia propionica
P. limphophilum С. limphophilum
* Предложен в 1983 г. (Воробьева и др., 1983), но официального статуса вида не получил. В 2000 г. после изучения кокковых пропионовокислых бактерий методами молекулярной биологии он был переименован и включен в род Luteoccus (Vorobjeva, 1999)
1.1.2 Общая характеристика классических пропионовокислых бактерий
Главное место обитания классических пропионовокислых бактерий — твердые сычужные сыры. Имеются также данные о выделении ряда видов из почвы, силоса и бродящих олив.
Клетки грамположительные, неподвижные, спор не образуют.
Пропионовокислые бактерии, как правило, каталазоположительные. У них также обнаружены супероксиддисмутазная и пероксидазная активности. Содержание G+C в составе ДНК варьирует от 53-67%. Бактерии образуют менахиноны. Основным типом жирной кислоты, экстрагируемой из целых клеток, является Cis - насыщенная жирная кислота с разветвленной цепочкой.
Таксономическим признаком рода служит состав клеточных фосфолипидов. Для рода Propionibacterium основной фосфолипид представлен мономанозидом
11
глицерилфосфорилилмиоинозита. Главный гликолипид пропионовых бактерий представлен 1-0 - пентадеканоил - 2-0 (6-0 - гептадеканоил- LD - маннопиранозил) миоинозитом и включает жирные кислоты (пентадеканоидную, гептадеканоидную), маннозин и инозит.
Все штаммы проявляют высокую устойчивость к сульфамидам. ПКБ устойчивы к хлортетрациклину, к лизоциму чувствительны только клетки P. freudenreichii, а низин оказывает сильное ингибиторное действие на клетки бактерий.
Это аэротолерантные или микроаэрофильные бактерии, хотя есть штаммы, предпочитающие аэробные условия. Их аэротолерантность обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода.
Бактерии растут в пределах температуры 15-40°, возможен рост и при более низкой температуре - 2.8-7.2°С. Оптимальная температура для классических пропионовых бактерий - 28-30°С. Оптимальными значениями рН для роста 6.5-7.0; при рН 5.0 рост практически отсутствует, при рН ниже этого критического уровня жизнеспособность бактерий сильно снижается.
1.1.3 Морфология
Пропионовокислые бактерии представляют собой плеоморфные палочки, 0.5- 0.8 х 1-5 мкм, часто булавовидной формы с одним концом закругленным, а другим суженым; некоторые клетки могут быть кокковидными, раздвоенными или разветвленными, но нитчатые формы отсутствуют. Наблюдается рудиментарное ветвление в аэробных или анаэробных условиях при низких значениях рН. Размножаются бинарным делением.
Цвет колоний у пропионовокислых бактерий желтый, оранжевый, кремовый, красный и коричневый. Их отличает от других бактерий своеобразное "палисадное" расположение клеток наподобие "китайских иероглифов". Клетки неровные, могут быть покрыты слизью, образуя слизистые тяжи. Ряд штаммов P. thoenii и P. jensenii образуют, полисахаридные капсулы. Слизистые капсулы могут защищать клетки от внедрения бактериофага или других вредных воздействий. Отмечается сильное разрастание муреинового слоя, а также поперечных стенок.
12
Рис. 1.1 Полиморфизм клеток P. freudenreichii, увеличение х 6330
1.1.4 Анатомия
Анатомия клеток представляет типичную картину для грамположительных бактерий. Толщина клеток меняется с возрастом культуры, находясь в пределах 20.0 -30.0 нм. При окрашивании солями свинца различаются два слоя клеточной стенки. Цитоплазма представляет собой область средней электронной плотности, содержащей рибосомы (иногда полисомы), мезосомы и метахроматиновые гранулы, состоящие в основном из полифосфатов. Поскольку полифосфатные гранулы появляются в основном в старых культурах пропионовых бактерий, они могут рассматриваться как хранители пирофосфата до использования его во время реактивации клеток. Нуклеарная область представлена фибриллами.
1.1.5 Питательные потребности
Пропионовокислые бактерии характеризуются хорошо развитыми биосинтетическими способностями и могут расти на простой синтетической среде с аммонийным азотом в качестве единственного источника азота при добавлении к среде пантотеновой кислоты и биотина, а для некоторых видов тиамина. Аминокислоты стимулируют рост бактерий, но не существенны для него. Никотинамид также стимулирует рост. У некоторых штаммов бактерий обнаружена способность к азотфиксации.
1.1.6. Брожение, осуществляемое пропионовокислыми бактериями
13
Первооткрывателем пропионовокислого брожения является Фитц, который открьш и дал уравнение анаэробного превращения лактата в пропионат, ацетат, СО2 и НгО. X. Вуду принадлежит открытие гетеротрофной фиксации СО2 именно на пропионовых бактериях (Гусев, Минеева, 1992).
Брожение — это метаболический процесс, при котором регенирируется АТФ, а продукты расщепления органического субстрата могут служить одновременно и донорами, и акцепторами водорода.
В анаэробных условиях представители ПКБ сбраживают глюкозу, сахарозу, лактозу и пентозы, а также лактат, малат, глицерин и другие субстраты. Расщепление гексоз идет по фруктозобисфосфатному пути. Затем к молекуле пирувата присоединяется СОг, что приводит к формированию четырехуглеродного скелета. Этот процесс получил название гетеротрофной ассимиляции углекислоты. Реакция карбоксилирования пирувата, приводящая к получению щавелево — уксусной кислоты (ЩУК) получила название Вуда Веркмана.
СН3
I метилмалоннл.КоА-
СН,—СО—СООН+СООН—СН—СО ~ S—КоА+
ПИруват меТИЛМаЛОНИЛ-КоА карбоксилтрансферааа
: СООН—СН2—СО—СООН+СН3—СН2—СО ~ S—КоА. ЩУК пропионил-КоА
Пировиноградная кислота карбоксилируется в реакции, катализируемой биотинзависимым ферментом, у которого биотин выполняет функцию переносчика СОг. Донором СО2 группы служит метилмалонил - КоА. ЩУК в результате Зх ферментных этапов превращается в янтарную кислоту.
::СООН—СНо—СО—СООН + НАД-
hfa •-¦¦*. '¦ ЩУК " ••
малат-
>l .'^СООН—СН2—СНОН^СООН+'НАД+;
• -11..' яблочная кислота
1 ..''tf v-?>i»;i.*; ¦ : ¦ • " . . ¦ фумараза *
icooh---------*-
14
фумарат-
СООН—СН=СН—СООН+ФАД-Н2
редуктаза
5? СООН—CH2-GH2-COOH 4- ФАД+. янтарная кислота
Затем происходит перенос КоА- группы с пропионил - КоА на янтарную кислоту (сукцинат), в результате чего образуется сукцинил - КоА и пропионовая кислота.
соон—сн2—сн2—соон+сн3—сн2—со—s—КоА КоА'трансферзза-
пропионил-КоА
—CH2—CH2—CO^-S—КоА+СН3—СН2г-СООН.
сукцинил-КоА пропионовая
кислота
Пропионовая кислота выводится из процесса и накапливается вне клетки, а сукцинил КоА превращается в метилмалонил - КоА под действием кофермента метилмалонил КоА мутазы, которая в качестве кофактора содержит витамин Bi2.
метвлмалонжл* '
метилмалоивл^КоА
Наряду с пропионовой кислотой в качестве продуктов брожения образуются уксусная, янтарная кислоты и СОг. Кроме основных продуктов в разных количествах в культуральной жидкости пропионовых бактерий обнаружены молочная, муравьиная, изовалериановая кислоты, этиловый и пропиловый спирты, уксусный и пропионовый альдегиды, ацетоин, диацетил, диметилсульфид.
Пропионовокислое брожение обнаружено у бактерий родов Propionibacterium, Rhodospirillum, Micrococcus и др., но только у пропионовых бактерий оно служит главным способом получения энергии, в то время как у других это дополнительный способ существования.
15
Брожение не исчерпывает всех возможностей получения энергии этой группы бактерий, хотя гликолитическое расщепление глюкозы является основным путем. У пропионовых бактерий обнаружен и окислительный пентозрфосфатный путь, реакции ЦТК, активное флавиновое дыхание и окислительное фосфорилирование, сопряженное с электонтранспортной системой. У некоторых видов обнаружен эффект Пастера: в присутствии кислорода воздуха происходит переключение с брожения на дыхание. ПКБ могут синтезировать гем-содержащие белки. В их клетках обнаружены цитохромы.
1.1.7 Синтез витамина В и
В пропионовокислом брожении участвуют тиамин, биотин, пантотеноевая кислота, рибофлавин, витамин В12. Витамины Вг и В12 бактерии синтезируют самостоятельно и в значительных количествах, а в других витаминах существует потребность.
Витамин В12 относится к тетрапирольным соединениям и имеет наиболее сложную структуру из всех неполимерных соединений.
•СНг Me ме
H^N-OC-CH
но-сн,
Рисунок 1.2. Витамин Bi2
16
Корриновое кольцо и нуклеотидное ядро синтезируют только бактерии и некоторые водоросли, а р-лиганды могут присоединяться к кобальту ферментными системами животных и человека.
Витамин Bi2 относят к первичным метаболитам пропионовых бактерий, он накапливается в клетках в виде коферментных форм неполных корриноидов. Он нужен для роста и его накопление идет с небольшим отставанием параллельно росту бактерий. В первые 10 - 14 ч. рост бактерий происходит за счет эндогенного витамина инокулята. Необходимыми условиями для синтеза витамина является определенный уровень метаболитов, таких как сукцинил - КоА, глицин, метионин, АТФ, НАД, ГТФ, флавины. Молодая культура содержит больше этих соединений, но и сама активно утилизирует их. Таким образом, на; раннем этапе развития возникает конкуренция между процессом биосинтеза витамина и другими анаболическими процессами за общие предшественники, поскольку ФАД, НАД и АТФ входят в молекулу витамина как структурные единицы.
Показано, что факторы, снижающие скорость роста бактерий — низкая температура, замена органических источников азота минеральными, присутствие незначительных количеств антибиотиков - приводят к увеличению продуктивности клеток по витамину В12.
Процесс биосинтеза витамина В12 очень чувствителен к значениям рН, что накладывает определенные проблемы на поддержание постоянного значения рН при промышленном производстве. При значении рН менее 5.5 происходит вымывание витамина из клеток. Температура также оказывает значительное влияние на биосинтез. Воробьева и др. (1967) показали, что максимальное накопление витамина происходит в биомассе, выросшей при 30°С.
Наиболее активными продуцентами витамина В12 являются штаммы P. shermanii и Р. freudenreichii, которые используют во многих промышленных производствах. Получен мутант P. shermanii M-82 с помощью которого получают до 58 мг/л витамина В12.
Витамин В12 применяют в медицине. Здоровые люди получают его с пищей (печень, мясо). В зеленой части растений витамин не обнаружен. Люди не утилизируют корриноиды, образуемые микроорганизмами кишечника. Существует множество заболеваний, связанных с недостатком витамина В12 в организме людей и среди них психические расстройства, помутнение зрения, мегалобластическая анемия, которая проявляется в изменении морфологии крови, нарушении функций крови и клеток мозга. Кроме того, он необходим для функции нервных клеток, синтеза ДНК и ферментов. Витамин В12 находит применение в животноводстве в качестве добавки к кормам.
17 |
